组员：张业妹 熊丽丽 俞树惠 莫晓雨

摘要：以保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）为原料，通过稀释法和涂布法相结合的方法对其所含的微生物含量进行定量测定，再通过划线纯种分离法、革兰氏染色法、微生物试剂盒鉴定细菌相结合的方法来对其中所含的细菌纯种分离及鉴定。

 

关键词：培养基的配制、消毒和灭菌、样品处理、平板菌落计数、微生物纯种分离培养、微生物试剂盒、鉴定

引言：保罗微生物酵素是一类含有细菌、放线菌和酵母菌等三大类几十种微生物的微生物菌剂，由北京中加保罗生物科技有限公司生产，包括微生态制剂、菌肥、植物生长促进剂、饲料增效剂等系列产品。酵素菌饲料添加剂由细菌、放线菌和酵母菌等三大类几十种微生物组成，具有促进家畜生长、减少家畜疾病、提高饲料利用率等作用。通过实验可以检测有效活菌数是否达到10亿/克。从而证明保罗微生物酵素有促进家畜生长、减少家畜疾病、提高饲料利用等优点。可以使消费者不再质疑保罗微生物酵素的作用，放心使用保罗微生物酵素。

1．概述

保罗微生物酵素是一类含有细菌、放线菌和酵母菌等三大类几十种微生物的微生物菌剂，由北京中加保罗生物科技有限公司生产，包括微生态制剂、菌肥、植物生长促进剂、饲料增效剂等系列产品。应公司要求，对该产品的微生物数量作定量定性检测。

 

2．材料与方法

实验材料：保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂） 样品简介（来源：生产商宣传材料）： 该菌剂由细菌、放线菌和酵母菌等三大类几十种微生物组成，具有促进家畜生长、减少家畜疾病、提高饲料利用率等作用，有效活菌数大于10亿个/克。

2.1保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）中微生物数量的检测

实验器材

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、高压灭菌锅、恒温水浴锅、涂布棒、酒精灯、酒精棉、酒精、无菌操作台、打火机、培养皿

实验试剂

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、自来水、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4·3H20、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、（NH4）2SO4·7H2O、KH2PO4、Na2HPO4、酵母膏、孟加拉红

实验原理

因为，保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）由细菌、放线菌和酵母菌等三大类几十种微生物组成，而这三大类微生物不能在同一种培养基里生长，所以必须配置三种分别适合这三类微生物生长的培养基来培养。

另外，要对该菌剂中的微生物数量进行检测需要用到微生物的间接计数法，通过数培养出来的微生物菌落数来计算该种微生物的数量，通过三种培养基中微生物菌落数的相加来得到该菌剂中微生物的数量。

此外，据生产商宣传资料可知有效活菌数大于10亿个/克，那么为了能在平板中记出有效地菌落个数需要对菌剂进行一定定程度的稀释。

这样通过有效菌落的计数及相加和取平均值就能初步的了解的该菌剂中所含有效活菌的个数了。

实验内容及步骤

1. 培养基的配制

（1） 牛肉膏蛋白胨固体培养基—培养细菌用

称取牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，琼脂12.5g，自来水500ml。将各药品一起加热溶解（除琼脂），调节pH至7.2-7.4。将配好的培养基（500ml）平均分装到两个三角瓶（500ml）中，每个瓶中装入6.25g琼脂，盖上瓶塞，包扎待灭菌。

（2） 高氏一号培养基—培养放线菌用

称取可溶性淀粉10g、KNO3 0.5g、NaCl 0.25g、K2HPO4?3H20 0.25g、MgSO4?7H2O 0.25g、FeSO4?7H2O 0.005g，蒸馏水500ml。先用少量冷水把可溶性淀粉调成糊状，用文火加热，然后再加水及其他药品（除琼脂），待各成分溶解后再补足500ml。调节pH至7.4-7.6。将配好的培养基（500ml）平均分装到两个三角瓶（500ml）中，每个瓶中装入6.25g琼脂，盖上瓶塞，包扎待灭菌。

（3） 酵母菌富集培养基—培养酵母菌用

称取葡萄糖25克。尿素0.5克，七水合硫酸铵0.5克，磷酸二氢钾0.25克，磷酸氢钠0.25克，七水合硫酸镁0.5克，七水合硫酸铁0.05克，孟加拉红0.015克，将其溶于500 ml蒸馏水中，并将pH调到4.5。将配好的培养基（500ml）平均分装到两个三角瓶（500ml）中，每个瓶中装入6.25g琼脂，盖上瓶塞，包扎待灭菌。

2. 实验器材及试剂的灭菌

将所需的试管、培养皿、移液管、装有培养基的锥形瓶、装有玻璃珠的锥形瓶、生理盐水用报纸包好，放入灭菌锅中灭菌（灭菌条件是121℃下灭菌20分钟）。

3. 制备菌种

称1克保罗微生物酵素，至灭过菌且装有玻璃珠的锥形瓶中，取99ml无菌生理盐水溶解，摇晃20分钟左右，静置，待用。（注意：需在无菌条件下进行操作）

4. 菌种的稀释

分别移取4.5ml无菌生理盐水至六支试管中，移取0.5 ml原菌液支第一支试管中，配制成浓度为10﹣3的菌液，混匀，再从10﹣3中移取0.5 ml至第二支试管中，配制成10﹣4的菌液，依次操作下去，直至10﹣8为止。（注意：不同浓度的菌液要用不同的移液管移取）

5.  菌种的平板培养及间接计数

（1）倒平板

待培养基冷却至40℃~50℃时，在无菌条件下开始倒平板，每个皿大约15ml，每种培养基倒9块培养皿，待用。

(2)移取稀释后的菌液

移取10﹣5~10﹣8四个梯度的菌液进行培养，从10﹣5中移取0.2ml菌液至标有10﹣5的牛肉膏蛋白胨培养基平板中，一次类推下去，直至10﹣8为止，再移取0.2ml无菌水至空白的牛肉膏蛋白胨培养基中，每个浓度做两块平板。

在移取菌液至高氏一号培养基中与酵母菌富集培养基中时方法同上。

(3)涂布

在无菌条件下，将皿盖开启一缝，右手拿涂布棒把平板上的菌液轻轻涂开、均匀铺满整个平板，并防止平板培养基破损。（涂布棒在使用前应用酒精灯火焰灭菌，待涂布棒冷却后在涂布）

(4)培养

将牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）放到37℃恒温培养箱中，倒置培养1~2天。

将高氏一号培养基（放线菌）放到28℃恒温培养箱中，倒置培养3~7天。

将酵母菌富集培养基（酵母菌）放到28℃恒温培养箱中，倒置培养1~2天。

(5)计数

取出培养后的平板，选出菌落数在30~300个/皿范围内的各皿，计算每皿的菌落数，并将结果记录下来。在高密度分布的菌落平板中，选计有代表性的1/8~ 1/4区域后粗略统计菌落数，以判断稀释中的误差情况供参考。恒温培养

实验注意事项

1.培养基的分装上培养基的装量不超过总容量的1/2~3/5为宜

2.为了使培养基的计数可计需要配置到一定的浓度才行

3.在使用涂布棒时要做好灭菌工作，涂时要均匀菌液

4.移取菌液时要注意使用相应的移液管，不要混用

5.培养时每种菌要选用适宜的培养温度

6.计数时多不可数的不要计，选择适当的培养基计数

2.2保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）中细菌的纯种分离及鉴定

实验器材

恒温水浴锅、培养皿、接种环、酒精灯、打火机、载玻片、盖玻片、擦镜纸、无菌滴管、显微镜、恒温培养箱

实验试剂

牛肉膏蛋白胨培养基、培养出的细菌菌落、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红染液、油、二甲苯、微生物试剂盒、细菌培养液、矿物油

实验原理

要想知道保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）中到底有什么菌就必须对菌进行纯种分离，利用平板划线法可以在D区得到近似于纯种的单菌落。再利用革兰氏染色法观察所分离纯化出来的细菌的形态特征来选择适当的试剂盒鉴定细菌，从而通过试剂盒中各格的颜色结合电脑上的相关软件来判断细菌是哪种菌

实验内容及步骤

1.  细菌的分离纯化（用平板划线法）

（1） 作分区标记：在皿底用记号笔划分成4个不同面积的区域，使A＜B＜C＜D，且各区的夹角应为120°左右，以便使D区 与A区所划出的线条相平行、美观。

(2)挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作要求挑取少量含菌试样。

（3）先划A区：将皿盖开启一缝，右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划3~4条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。

（4）划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区而移至B区，随即在B区轻巧地划上6~7条致密的平行线，接着在以同样的操作在C区和D区划上平行线，并使D区的线与A区的平行（但不能与A区B区的线条接触），最后，盖上皿盖，烧去接种环上的残菌样。

（4）  培养：将划好线的平板放置37℃的恒温培养箱中，倒置培养1~2天

2.革兰氏染色法鉴别细菌

(1)制片：在载玻片上滴一滴水，然后用接种环在D区挑取少量细菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成薄的菌膜。

(2)固定：涂片在空气中干燥。手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通过3次（用手指摸涂片反面，以不烫手为宜）待冷却后再染料。

(3)初染：用手执玻片一端，加草酸铵结晶紫染色液（加量以盖满菌膜为度）。倾去染色液，用自来水小心的冲洗。

(4)媒染：滴加碘液，染1~2min，水洗。

(5)脱色：滴加95％乙醇，将玻片稍摇晃几下即倾去乙醇，如此重复2~3次，立即水洗，以终止脱色。

（6）复染：滴加番红染色液，染色2~3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。

(7)镜检：先现在十倍镜下找到视野，调到40倍镜下，找到菌不是很密集的地方，旋下载物台，在菌膜上滴加香柏油，然后上升载物台使得100倍的物镜头没入油中，调节细调旋钮至图像清晰，但不可离开油内，区分出革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，观察细菌的形态。3.用试剂卡进一步鉴定细菌种类

根据革兰氏染色的结果，判断该细菌是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，通过显微镜观察可以判断出该细菌的形态（杆状、球状等），根据这两项结果选择适合的试剂卡进一步鉴定细菌。操作方法按照试剂卡上的说明书培养菌液与滴加辅助试剂。最后在电脑上用相应的软件鉴定。

实验注意事项

1.划线时注意画完A区要烧掉菌再画B区

2.又镜镜检时要用100倍油镜，用完要用二甲苯擦镜

3．结果与讨论

3.1保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）中微生物数量的检测

实验结果

1.细菌的平板培养结果

 

 

细菌平板

2.计数结果

稀释浓度	10-6	10-7	10-8
菌落数	107	31	6
	119	34	7
平均数	113	32.5	6.5

选择10-6的浓度的平板作为参考数值：

活菌数（个/克）=113×10（6）

 

结果讨论

实验设计时因各种菌所需的培养基不同，所以用了三种培养基，计数时就要分别计数。而在做实验时发现只有细菌的培养基有菌长出，另外两种菌的培养基没有菌长出，所以计数出来的结果只是保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）中细菌的数量。出现这种现象有以下几种可能性：

1． 宣传资料不准确。可能保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）里面根本没有酵母菌和放线菌。

2． 实验操作失误使酵母菌和放线菌没有长出来。可能是培养基配置的方法有误，也有可能时书上说的适宜温度并不适合酵母菌和放线菌生长。为了验证这两种原因需要重新配制培养基和设置不同的温度进行菌的培养，因实验时间有限，没能验证这两种原因的可靠性。

 

3.2保罗微生物酵素（酵素菌饲料添加剂）中细菌的纯种分离

实验结果

1．划线培养结果：

2． 革兰氏染色结果

A菌

 

B菌

3．试剂卡测试结果

（1）杆状菌

细菌编码	5300
棒状杆菌	1	2		3	4	5		6	7
	＋ 红色	＋ 黄色		－ 蓝色	－ 蓝色				－ 蓝色		A
	－ 黄色	＋ 黄色		－ 紫色	－ 蓝色						B
	＋ 棕色	－ 无色		－ 蓝色	－ 蓝色						C
细菌名称			鉴定值				相似度			英文名
水生棒状杆菌			0.99				0.65			Corynobacterium aquaticum

（2）链球菌

细菌编码	57101
链球菌科	1	2		3	4	5	6	7		8
	＋ 红色	＋ 粉色		＋ 浅黄色	－ 无色	＋ 黄色		－ 蓝色		＋ 黄色	A
	－ 浅黄色	＋ 棕色		－ 无色	－ 蓝色	－ 蓝色		－ 蓝色		－ 蓝色	B
	＋ 浅黄色	＋ 浅黄色		－ 无色	－ 蓝色	－ 蓝色	紫红色	黄色			C
细菌名称			鉴定值			相似度			英文名称
中间链球菌			0.99			0.02			Stroptococcus intormodius

或

细菌编码	47101
链球菌科	1	2		3	4	5	6	7		8
	－ 黄色	＋ 粉色		＋ 浅黄色	－ 无色	＋ 黄色		－ 蓝色		＋ 黄色	A
	－ 浅黄色	＋ 棕色		－ 无色	－ 蓝色	－ 蓝色		－ 蓝色		－ 蓝色	B
	＋ 浅黄色	＋ 浅黄色		－ 无色	－ 蓝色	－ 蓝色	紫红色	黄色			C
细菌名称			鉴定值			相似度			英文名称
血液链球菌			0.99			0.64			Streptococcus sanguis

 

结果讨论

通过划线纯化培养可能纯化出了两种菌，通过培养的结果发现一种是菌落毛绒状的A菌，另一种是菌落光滑状的B菌。通过革兰氏染色观察出A菌是革兰氏阳性杆状菌，B菌是革兰氏阳性链球状菌。通过革兰氏染色观察出来的菌形态分别用试剂盒鉴定出菌的种类。
通过试剂盒鉴定出棒状菌为水生棒状杆菌 简介：水生棒状杆菌是一种它的形态生化特征都类似于李斯特菌的革兰氏阳性棒状杆菌，因它寄生在水中而得名。近年来，由棒状杆菌引起人类感染的报告越来越多，但作为水生棒状杆菌引起人类感染的报告并不多见。目前国内尚未见由水生棒状杆菌引起人类感染的报告，而由水生棒状杆菌引起鸽子的暴发感染在国内外尚未见报道。（参考我国首次由水生棒状杆菌引起的鸽子暴发感染 中国人兽共患病杂志 1999年第6期第15卷 调查与防制 作者：刘丽文　赵鸿梅　李　宁　宋丽君）

通过试剂盒鉴定出链球菌为中间链球菌或血液链球菌（因缺少VP试剂，所以结果不确定） 中间链球菌简介中间型链球菌为一组链球菌（Str. intermediusgroup）,包括3个菌种，即中间型链球菌（Str.intermedius）、星座链球菌（Str．contellatus）和咽峡链球菌（Str.anginosus）,中间型链球菌93％非β-溶血，38％的星座链球菌和12％的咽峡链球菌呈β-溶血。该组细菌主要存在于人类口腔中,可自牙龈缝隙、牙斑、根管中分离获得,也存在于喉和鼻咽部，尚寄殖在胃肠道。该组细菌可致牙龈脓肿,并可由此引致败血症、心内膜炎。值得注意的是该组链球菌尚可引起脑脓肿,并常与厌氧菌同时存在。腹膜炎、肝脓肿,盆腔脓肿亦可发现。口咽部存在的中间型链球菌组细菌的吸入可导致吸入性肺炎，并可并发肺脓肿和脓胸,发生纵隔炎者亦有报道。其他尚可引起骨髓炎、化脓性关节炎,鼻窦炎、皮下脓肿、蜂窝织炎等。 血液链球菌简介血液链球菌(S. sangu is, S. s) 属口腔链球菌群, 其许多成分在牙周微生态环境中具有拮抗引起龋齿的口腔致病菌的活性的作用。

另外鉴定出的菌之所以相似度不是100%，可能是纯化出的菌不是一种菌，从而在遇到试剂盒中的那些试剂时出现了混淆，使得所有颜色表现出的不是100%的某种菌。如果这样的话就需要进一步纯化分离，可以用纯化分离法中的细胞纯来纯化，鉴于本实验的条件和时间问题不能进行验证。

参考文献

1.《微生物学实验教程》周德庆主编

2.《微生物教程》周德庆

3．我国首次由水生棒状杆菌引起的鸽子暴发感染 中国人兽共患病杂志 1999年第6期第15卷 调查与防制 作者：刘丽文 赵鸿梅 李宁 宋丽君