一、肿瘤干细胞研究现况

近年来。对TSC的研究在肿瘤学研究中开辟了新的领域.随着科研人员对其认识与研究的同时，已积累了较多的相关研究资料.主要体现在以下几方面:

(一)如何鉴定肿瘤干细胞

目前.从形态学上很难区分TSC与干细胞及肿瘤间的差异。根据已有的资料显示，大约有以下几种初步鉴定方法。

1.基于癌干细胞特征性的表面标记某些’PAC有特征性的表面标记，而同种肿瘤缺乏这种特征性标记.这样易于鉴定和分离。如1994年John等从急性髓样白血病中分离了最初的HSC。他们将人急性髓样白血病细胞植入到SC'ID小鼠，研究急性髓样白血病细胞的自我更新潜能。通过荧光标记细胞表面蛋白进行表型细胞分离，实验结果显示.只有一小部分急性髓样白血病细胞移植到SCI!)鼠体内可以产生肿瘤.这些致瘤性细胞具有CD34+ CD38-的表型。最近.大最研究进一步证实了急性髓样白血病中TSC的表型是CD34 CD38- CD90- IL-3R+CD71- HLA-DR-CD117-。类似的研究在NOD/SLID小鼠大脑成瘤实验中得到证实，Sin妙、等预先把C'1)133’细胞确定为唯一的能再生成类似人肿瘤或原肿瘤的细胞。约19%^-22% CD133+细胞能产生CD133斗肿瘤细胞和CD133肿瘤细胞.表明CD133‘细胞与其自身肿瘤细胞的增殖有很大相关性。相反.即使将多达。。1 000倍的CD133一肿瘤细胞注射到小鼠脑部.该细胞也不能形成肿瘤。Al一Hajj等运用表面标记CD14, C'D24 , ESA将9例乳腺癌患者术后癌细胞分群后接种到

NOD/SCID小鼠.12周后有8例接种了100个ESA } lin CD44' CD24 `"1-癌细胞的小鼠形成乳腺癌.而具有其他表型的癌细胞即使接种1000-50000个到NOD/SCID小鼠.16-29周后也不能形成乳腺癌.结果提示。相比于其他表型的癌细胞亚群，ESA十lin-CD44' CD24-'0"具有更强的增殖能力和肿瘤形成能力。此外，前列腺癌TSC特征性的表面标记为('DD14+ /az {3i" /('D133+，因其具有更强的体外致瘤能力。

2.基于肿瘤细胞体外培养的特性

(1)利用肿瘤细胞体外培养成球生长特性。Singh等于2003年将儿童髓母细胞瘤、星型胶质细胞瘤及室管膜瘤等组织制成单细胞悬液，用无血清培养基可维持肿瘤细胞的未分化状态.加入表皮生长因子和碱性成纤维生长因子等可促进肿瘤细胞的增殖.部分细胞形成肿瘤球。该肿瘤球经过培养后。不同病理类型的肿瘤细胞都再次形成了与原代肿瘤球相同的肿瘤球。如CD133”肿瘤细胞分化成和原来类似的肿瘤.而CD133一肿瘤细胞则不具有此特性。最近有研究显示.挠骨神经胶质细胞可经人室管膜瘤起源的肿瘤细胞培养获得.该方法可适用于各种神经肿瘤.用于成功分离神经’I ;SC。部分肿瘤球细胞具有增殖和自我更新的能力.因此，肿瘤细胞体外培养成球生长特性被用来研究肿瘤细胞自我更新能力或用其作为鉴定TSC的方法之一。

(2)基于肿瘤细胞体外形成克隆能力。克隆形成试验是测定单个细胞增殖能

力的一种有效方法。如常见的软琼脂克隆形成实验。该培养法可选择性地使已转化的细胞进行增殖.而抑制正常细胞的增殖。单个细胞形成克隆生长潜能不同。据此可分为完全克隆、副克隆和部分克隆三类.其增殖潜能也依次不断降低。能形成完全克隆的细胞则是干细胞。在软琼脂培养基上形成克隆的能力和在动物体内形成肿瘤的能力通常是平行的.如鼠黑色萦瘤B16F10细胞，在软琼脂培养基上，CD133+和CD14-‘细胞克隆形成率分别高于CD133和('D14细胞。在小鼠体内致瘤性也分别强于CD133’和CD44一细胞。

3.基于SP细胞特性从良性和恶性人肾组织中都能分离出SI)细胞，在体外

培养时可高度增殖，而在C6, MCF27, B104, HeLa细胞系中还存在SI〕亚群。其中C6的SP细胞具有多向分化和少数可成瘤的特性。从神经胶质瘤U373和乳腺癌MCF7细胞系以及前列腺癌细胞中分离的SP细胞.比相应的非SP细胞有更高的致瘤性。由于肿瘤、干细胞和TSC的信号传导通路之间可能拥有共同的途径.而SI，细胞又与干细胞有很多共性.是认识和理解干细胞特性的‘.模式”.因此.已有许多报道将SP作为分离TSC的方法之一。并且在乳腺癌、卵巢癌等TS(’的鉴定上作为重要的指标(当然对此也有一些不同看法)。

4.基于千细胞含有永生化DN八链特性澳脱氧尿啥睫核首(Bromodeo-xyuridinc. BrdU)是DN八前体胸腺啥吭核普类似物.通过竞争掺入S期细胞单链DNA核奋酸序列替代胸腺咤咙。在含有BrdU的环境中细胞进行DNA复制时.BrdU可专一替代胸腺嚓咙核苔.而掺入到新复制的DNA核奋酸链中。与短期增殖细胞(transit amplifying cells. TAC)相比.干细胞是静息细胞.其通过高度形成克隆能力而增殖，但因DNA链合成存在着碱基错配的可能，在细胞分化时本能地限制了干细胞的复制。由于DNA这种不常发生的错配特性.在分裂子代细胞时.新合成的DN八链常趋向于TAC.经过多次快速的细胞循环.用BrdU标记的DNA在’['AC中逐渐减少以致不易检测.而能检测到标记的DNA细胞可能是干细胞.其BrdU标记的DNA Lt TAC中BrdU标记的DNA滞留时间更长。成7永生化(模板)DNA链。鉴定BrdU标记滞留细胞(label-retaining cells. LRC)通常可作为干细胞的一个标记.也有用BrdU标记滞留试验来鉴定TSC的报道.但这种方法还有待进一步证实。

5.动物致瘤性试验动物致瘤性试验是指用一定数量的肿瘤细胞悬液接种

动物相应部位，能够生长成为实体瘤.其组织学形态与原发瘤相似。如上述分离的CD133斗脑胶质瘤细胞、ES八‘CD44+ CD24-/low乳腺癌细胞、CD44+/az价/CD133‘前列腺癌细胞等初步鉴定的TSC，一般均要在NOD/SCID小鼠进一步鉴定。该方法是鉴定TSC的金标准。

(二)正常干细胞与肿瘤干细胞间的分子联系

正常干细胞自主更新途径的失调所引起的癌性突变显示.干细胞与TSC之间存在着分子联系，如Wnt币一连环蛋白、Notch和SHH途径等。Wnt巾一连环蛋白信号转导途径在胚胎发育中起更要作用.该信号级联作用始于胞外Wnt分子与位于细胞膜上受体组成的受体复合物结合.而发生系列反应.进而阻断Q一连环蛋白的磷酸化、泛景化降解，使大量游离的R一连环蛋白在胞质中聚集并进入细胞核内，与淋巴样增强因子和T细胞因子结合形成复合物.从而激活增殖一启动基因的转录。

研究显示，导入Wntl基因的小鼠乳腺SP细胞比例上升了2-3倍·而导入R一连环蛋白基因的小鼠乳腺SP细胞比例则上升了9倍。同样.导入Wnt3A基因的体外培养的人钻液表皮样癌细胞中SP细胞比例也可上升至70%. Wnt巾一连环蛋白通路还可赋予TSC耐药和耐辐射的能力。如人乳腺癌MC.F-7细胞经照射后，存活细胞R一连环蛋白表达上调，SP细胞比例增多。现已证实·在人类结肠癌、前列腺癌和卵巢癌中Wnt信号级联作用已出现失调。Notch信号途径调节细胞命运、维持干细胞生长和启动胚胎或胎儿出生后细胞分化的信号途径。Notch被致癌基因活化，会产生多种癌症.如Notch与Wnt等信号传导途径在肠上皮自我更新和癌症发生中扮演了重要的角色.而SHH信号途径活化与呼吸上皮细胞损伤后气道再生和小细胞肺癌发生有关，癌细胞前体和癌细胞之间的分子有紧密联系。

该信号途径在小脑神经胶质细胞前体增殖中起到重要作用，也是小脑成神经管细胞瘤基因突变的重要靶点。

图I一10(彩图10)显示了TGF一日信号传导通路在前肠癌抑制和正常肠内皮

层发育中的关键作用.提示该通路在抑制肝肿瘤和千细胞过渡到祖细胞和完全分化的肝细胞中有着双重作用。

(三)有关肿瘤干细胞靶向治疗

研究发现.白血病细胞对伊马替尼具有一定的耐药性.可能与其具有SP细胞

特性有直接关系。又如乳腺癌细胞系和胶质瘤细胞系的SP细胞高表达八B('(;2.这些敏感的细胞系在体外加入米托葱醒培养后，SI〕细胞比例可升高。Hirschmann等认为.可能正是这种药物选择作用使肿瘤易复发的患者体内肿瘤细胞的SP细胞比例增加.导致肿瘤细胞耐药、增殖能力增强.因此ABCG2可能用作为肿瘤治疗的靶点。依昔舒林是选择性使肿瘤凋亡药物.直接使R连环蛋白的梭基端结构域磷酸化，再由蛋白质酶体对其降解，使日一连环蛋白不能进入核内而阻止肿瘤细胞增殖。也有用反义RNA法以及敲除R一连环蛋白基因等手段下调份连环蛋白·或运用Tcf的显性失活突变、RNA干扰和针对相关分子的抗体.抑制p一连环蛋白/Tcf复合体形成及阻断此复合体对靶基因的激活.这些靶向治疗TSC'的设想和初步研究，对解决某些肿瘤耐化疗放疗及易复发的难题，均是积极的探讨。